Sorella del magistrato Paolo Borsellino, nel 1967 si laureò in farmacia all'Università degli studi di Palermo, esercitando la professione di farmacista nel capoluogo siciliano per vari anni. È divenuta, in seguito all'assassinio del fratello, testimone della lotta alle criminalità organizzate. Nel 1995 divenne vice-presidente di Libera, associazione anti-mafia fondata da don Luigi Ciotti, di cui è stata nominata presidentessa onoraria nel 2005. Carica che ha ricoperto fino a quando, nell'inverno dello stesso anno, si è candidata alla presidenza della Regione Siciliana.
Con Libera ha contribuito in maniera determinante all'approvazione delle legge 109/96 sull'uso sociale dei beni immobili confiscati alle mafie e sostiene attivamente il progetto Libera Terra.
Dal 1992 è impegnata attivamente nella società civile nel campo dell'educazione alla legalità democratica, nel diffondere una cultura di giustizia e solidarietà, non solo per tener vivo il ricordo del fratello e di tutte le vittime della mafia, ma soprattutto perché in particolare le nuove generazioni attraverso la conoscenza dei fatti acquistino consapevolezza dei propri diritti, del valore della legalità e della democrazia, una coscienza critica e responsabile che, una volta adulte, consenta loro di fare scelte giuste e coerenti per il bene loro e della collettività nella quale sono chiamate a vivere.
Dal 1994 assieme all'ARCI Sicilia e in seguito con la collaborazione di Libera contribuisce all'ideazione e alla crescita dell'iniziativa “La Carovana Antimafie”, un'esperienza ormai di carattere internazionale che mira a “portare per tutte le strade” l'esperienza di un'antimafia propositiva che vuole incidere positivamente sulla realtà economica, sociale, amministrativa dei luoghi che attraversa stringendo intrecci solidali ed etici tra i cittadini, le istituzioni e le diverse realtà della società civile organizzata presenti sui territori.
Dal 1998 è presidentessa della "Associazione Piera Cutino - guarire dalla talassemia", associazione senza scopo di lucro che promuove la ricerca medica contro la talassemia.
Numerose furono le sue iniziative contro le attività mafiose ed in favore dell'emancipazione delle donne. Tra le sue opere, impregnate proprio di questi temi, si ricordano Nonostante Donna. Storie civili al femminile (1996); La fatica della legalità (1999); I ragazzi di Paolo. Parole di resistenza civile (2002); Fare memoria. Per non dimenticare e per capire (2003); Rita Borsellino - Il sorriso di Paolo (2005).
Alla fine del 2005 si è intensificato il suo impegno politico accettando la proposta, veicolata dalla coalizione di centrosinistra nonostante le idee politiche del fratello, simpatizzante del Movimento Sociale Italiano, di candidarsi alla presidenza della Regione Siciliana nelle amministrative della primavera 2006. La sua candidatura è stata sancita dallo svolgimento di elezioni primarie (il 4 dicembre), nelle quali la Borsellino ha ottenuto il 66,9% dei consensi superando il suo contendente Ferdinando Latteri, rettore dell'Università di Catania.
La candidatura della Borsellino è stata sostenuta, in origine, soprattutto dai partiti "minori" di centro-sinistra (SDI, Rifondazione, Verdi, Pdci, Italia dei Valori ed altri), cui si unirono presto i Democratici di Sinistra. Sul fronte opposto era schierata la Margherita con Ferdinando Latteri. È stata designata, dunque, a sfidare il governatore siciliano uscente, Salvatore Cuffaro, candidato della Casa delle Libertà.
I risultati dello spoglio la vedono raggiungere il 41,63% dei consensi contro il 53,08% del presidente uscente che viene quindi rieletto. Il risultato anche se sancisce una sconfitta risulterà tutt'altro che deludente considerando che il suo avversario 5 anni prima aveva vinto con il 59,1% e il centrosinistra si era fermato al 36,6%. Infine le preferenze per la candidata Borsellino risulteranno superiori alla somma dei voti per i partiti della sua lista, al contrario dell'avversario.
Nel 2007, con Fabrizio Moro, ha girato il video di Pensa, diretto da Marco Risi con la partecipazione degli attori del film Mery per sempre.
Alle elezioni politiche del 2008 (13 e 14 aprile), Rita Borsellino è stata in corsa come capolista della Sinistra Arcobaleno per le regionali siciliane in tandem con Anna Finocchiaro del Partito Democratico. La Borsellino ha corso anche come capolista nella circoscrizione Emilia-Romagna e Lombardia per il Senato della Repubblica nelle liste della Sinistra Arcobaleno. [1] Risultata non eletta in entrambe le consultazioni elettorali, ha presentato ricorso al TAR siciliano contro presunte irregolarità formali, commesse nella provincia di Taranto, riguardanti la presentazione delle liste MpA e PdL.
Rita Borsellino è sposata dal 1969 e ha tre figli